二本鎖 RNA (dsRNA) ELISA キット

このキットは、配列に関係なく、60 塩基対 (bp) 以上の長さの dsRNA を定量測定するための、ビオチン-ストレプトアビジン システムを組み合わせた酵素免疫吸着法 (ELISA) です。プレートは抗dsRNA抗体でプレコーティングされています。サンプル中に存在する dsRNA が添加され、ウェル上にコーティングされた抗体に結合します。次に、ビオチン化抗 dsRNA 抗体が添加され、サンプル中の dsRNA に結合します。洗浄後、HRP-ストレプトアビジンが添加され、ビオチン化抗dsRNA抗体に結合します。インキュベーション後、未結合の HRP-ストレプトアビジンが洗い流されます。次に、TMB 基質溶液が添加され、HRP によって触媒されて青色の生成物が生成され、酸性停止溶液を添加すると黄色に変化します。黄色の濃度は、プレートに捕捉された dsRNA の標的量に比例します。吸光度は450 nmで測定されます。

応用

本キットは残存dsRNAを定量測定するためのキットです。

キットのコンポーネント

保管と安定性

1. 未使用のキットの場合: キット全体は 2 ～ 8℃ で保存可能です。保存安定性を確保するために、強い光を避けてください。

2. 使用済みキットの場合: マイクロプレートを開封したら、未使用のウェルをプレートシーラーで覆い、乾燥剤パックの入ったホイルパウチに戻し、ホイルパウチをジップシールし、使用後できるだけ早く 2 ～ 8℃に戻してください。その他の試薬は使用後速やかに2～8℃に戻してください。

必要な材料が提供されていない

1. 450±10nm フィルターを備えたマイクロプレート リーダー (450 および 650 nm の波長で検出できればより良い)。

2. マイクロプレートシェーカー。

3. RNase フリーのチップと遠心管。

動作フローチャート

あなたが始める前に

1. 使用前にすべてのキットのコンポーネントとサンプルを室温 (18 ～ 25℃) に戻してください。キットを一度で使い切らない場合は、今回の実験用のストリップと試薬のみを取り出し、残りのストリップと試薬は必要な状態のままにしておいてください。

2. 洗浄緩衝液: 40 mL の 20 倍濃縮洗浄緩衝液を 760 mL の脱イオン水または蒸留水で希釈して、800 mL の 1× 洗浄緩衝液を調製します。

3. 標準: 使用前にストック溶液を軽く回転または遠心分離します。提供される 4 つの標準の濃度は 5ng/μL です。UTP および pUTP dsRNA スタンダードの場合は、ストック溶液を STE バッファーで 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL に希釈して標準曲線を描きます。N1-Me-pUTP dsRNA 標準の場合、ストック溶液を STE バッファーで 2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0 pg/μL に希釈して標準曲線を描きます。5-OMe-UTP dsRNA 標準の場合、ストック溶液を STE バッファーで 4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 pg/μL に希釈して標準曲線を作成してください。標準液は次の表のように希釈することをお勧めします。

4. ビオチン化検出抗体および HRP-ストレプトアビジン作業溶液: 使用前にストック溶液を簡単にスピンまたは遠心分離します。希釈緩衝液を使用して使用濃度まで希釈します。

5. TMB サブステート: 必要な量の溶液を滅菌チップで吸引し、残りの溶液をバイアルに再度捨てないでください。TMB 基板は光に弱いため、TMB 基板を長時間光にさらさないでください。

プロトコルの使用

1. アッセイに必要なストリップの数を決定します。ストリップをフレームに差し込んで使用します。このアッセイに使用されなかった残りのプレートストリップは、乾燥剤とともにバッグに再梱包する必要があります。冷蔵保存の場合は袋の口をしっかり閉めてください。

2. 標準、ブランク、サンプルの各希釈液 100μL を適切なウェルに加えます。プレートシーラーで蓋をします。500rpmで振盪しながら室温で1時間インキュベートします。正確なアッセイを行うには、サンプルを STE バッファーで適切な濃度に希釈する必要があります。

3. 洗浄ステップ: 溶液を吸引し、各ウェルに 250μL の洗浄バッファーで洗浄し、30 秒間放置します。プレートを吸収紙の上にパチパチとはめて洗浄緩衝液を完全に廃棄します。合計4回洗います。

4. 100μL のビオチン化検出抗体作業溶液を各ウェルに加えます。プレートシーラーで蓋をします。500rpmで振盪しながら室温で1時間インキュベートします。

5. 洗浄ステップを繰り返します。

6. 100μL の HRP-ストレプトアビジン作業溶液を各ウェルに加えます。プレートシーラーで蓋をします。500rpmで振盪しながら室温で30分間インキュベートします。

7. 洗浄ステップを再度繰り返します。

8. 100μLのTMB基質溶液を各ウェルに加えます。プレートシーラーで蓋をします。室温で 30 分間インキュベートします。光を避けてください。基質溶液を加えると液体が青色に変わります。

9. 50μL の停止液を各ウェルに加えます。停止液を加えると液体が黄色に変わります。次に、マイクロプレートリーダーを実行し、すぐに 450nm での測定を実行します。

結果の計算

1. 各標準、対照、およびサンプルの重複測定値を平均し、平均ゼロ標準光学濃度を減算します。縦軸(Y)に吸光度、横軸(X)軸にdsRNA濃度をとった標準曲線を作成します。

2. 5 または 4 パラメータの非線形フィット モデルで、Curve Expert 1.3 や ELISA Calc などのコンピュータ ベースのカーブ フィッティング ソフトウェアを使用して計算を実行することをお勧めします。

パフォーマンス

1. 感度:

検出下限: ≤ 0.001pg/μL (UTP-、pUTP-、N1-Me-pUTP-dsRNA の場合)、≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA の場合)。

定量下限:0.0156 pg/μL (UTP-、pUTP-dsRNA の場合)、0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA の場合)、0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA の場合)。

2. 精度: アッセイ内 CV ≤ 10%、アッセイ間 CV ≤ 10%

3.回復率:80%~120%

4.直線性:0.0156-0.5pg/μL(UTP-、pUTP-dsRNAの場合)0.0312-1pg/μL(N1-Me-pUTP dsRNAの場合)、0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNAの場合)。

考慮事項

1. TMB の反応温度と時間は重要です。指示に従って厳密に制御してください。

2. 良好なアッセイの再現性と感度を達成するには、プレートを適切に洗浄して過剰な未反応試薬を除去することが不可欠です。

3. すべての試薬は使用前に完全に混合し、サンプルまたは試薬の添加中に混ざらないようにしてください。

4. 濃縮洗浄緩衝液(20x)中で結晶が形成された場合は、37℃に温め、結晶が完全に溶解するまで穏やかに混合します。

5. アジ化ナトリウム (NaN3) を含むサンプルのアッセイは避けてください。HRP 活性が破壊され、dsRNA の量が過小評価される可能性があります。

6. アッセイ中の RNase 汚染を避けてください。

7. 標準/サンプル、検出抗体、SA-HRP を振盪せずに室温で行うこともできますが、検出感度が 1 倍低下する可能性があります。この場合、UTP および pUTP dsRNA 標準は 2 pg/μL から希釈する必要があり、N1-Me-pUTP dsRNA 標準は 4 pg/μL から希釈する必要があり、5-OMe-UTP dsRNA 標準は 8 pg/μL から希釈する必要があることをお勧めします。さらに、HRP-ストレプトアビジン作業溶液を室温で60分間インキュベートします。フラスコシェーカーは不正確な結果をもたらす可能性があるため、フラスコシェーカーは使用しないでください。

典型的な結果

1. 標準曲線データ

2. 標準曲線の計算

3. ライナー検出範囲:0.0312-1pg/μL