EndoFree プラスミド マキシ キット
このキットは、改良された SDS アルカリ溶解法を使用して細菌を溶解し、一晩培養した 150 ～ 300 ml の細菌溶液からの抽出に適しています。粗抽出物は独自のエンドトキシン スカベンジャーと選択的に結合され、遠心分離によって分離されてエンドトキシンが除去されます。そして、シリカゲル膜は、高塩分かつ低pHの条件下で溶液中のプラスミドDNAに選択的に結合します。続いて洗浄緩衝液を加えて不純物やその他の細菌成分を除去します。最後に、低塩、高 pH の溶出バッファーを使用して、シリコン マトリックス膜から純粋なプラスミド DNA を溶出します。シリカゲル膜は特殊な吸着膜を採用しており、カラムとの吸着量の差が非常に少なく再現性が良好です。フェノール、クロロホルム、その他の有毒試薬は必要なく、エタノール沈殿ステップも必要ありません。このキットを使用すると、0.2 ～ 1.5 mg の純粋な高コピー プラスミド DNA を 80% ～ 90% の抽出率で迅速に抽出できます。このキットはエンドトキシンを除去する独自のプロセス処方を採用しており、エンドトキシンの含有量が極めて低く、細胞のトランスフェクション効果に優れています。抽出されたプラスミドは、酵素消化、PCR、インビトロ転写、形質転換、配列決定およびその他の分子生物学実験に直接使用できます。
保管条件
RNaseA は -30 ～ -15℃で保存し、0℃以下で輸送してください。
エンドトキシンスカベンジャーは2～8℃で1ヶ月保存可能、長期保存の場合は-30～-15℃で保存可能0℃以下で輸送してください。
その他の部品は室温（15 ～ 25℃）で保管し、室温で輸送してください。
コンポーネント
| コンポーネント | 10RXNS |
| RNase A | 750μL |
| バッファP1 | 75ml |
| バッファP2 | 75ml |
| バッファP4 | 75ml |
| エンドトキシンスカベンジャー | 25ml |
| バッファPW | 22ml×2 |
| バッファTB | 20ml |
| FastPure DNA Maxi カラム (各 50ml コレクション チューブ入り) | 10 |
| エンドトキシンフリー採取管 | 2×5 |
RNaseA:10 mg/ml、RNA の除去に使用されます。
バッファP1:細菌懸濁バッファーの場合、最初に使用する前に RNaseA をバッファー P1 に追加します。
バッファP2:細菌溶解バッファー (SDS/NaOH を含む)。
バッファP4:中和バッファー。
エンドトキシンスカベンジャー:粗プラスミド抽出物からエンドトキシンを効果的に除去します。
バッファPW:洗浄バッファーに、初めて使用する前に規定量のエタノールを加えます。
バッファTB:溶出バッファー。
FastPure DNA Maxi カラム:プラスミド DNA 吸着カラム。
コレクションチューブ50ml：ろ液回収チューブ。
エンドトキシンフリーの採取チューブ:プラスミド DNA コレクション チューブ。
準備した材料
無水エタノール、イソプロパノール、50 ml 丸底遠心管、および 50 ml エンドトキシンフリー遠心分離管。
アプリケーション
150～300mlの菌液からのプラスミドの大量抽出に適しています。一晩培養しました。
実験プロセス
1. 一晩培養した菌液 150 ～ 200 ml (300 ml 以下) を採取し、300 ml で遠心分離します。約11,000rpm（12,000×g）で1～2分間。上清を捨て、菌を回収します。
Δ 50mlを超える菌液を採取する場合は、同じ50mlチューブに菌液を加え、遠心分離、上清を捨てる等の操作を行うことで菌液を採取することができます。
複数回。
2. 7.5 ml の Buffer P1 (RNaseA が Buffer P1 に添加されているかどうかを確認してください) を遠心分離機に加えます。バクテリアの入ったチューブに入れ、ボルテックスまたはピペッティングで完全に混合します。
Δ このステップにおける細菌の完全な再懸濁は収量にとって重要であり、再懸濁後に細菌の塊があってはなりません。完全に混合されていない細菌の塊があると、溶解に影響を及ぼし、収率と純度が低下します。菌液の OD600 が 0.65 の場合、150 ml の菌液から抽出する場合は 7.5 ml の Buffer P1 を使用することが推奨されます。OD600 が 0.75 の場合、8 ml の緩衝液 P1 を使用し、それに応じて緩衝液 P2 および P4 の容量を変更する必要があります。菌液を200mlに増量した場合は、バッファ P1、P2、および P4 のボリュームは比例して増加します。
3. ステップ 2 の細菌懸濁液に 7.5 ml の緩衝液 P2 を加え、6 ～ 8 分間穏やかに上下に混合します。3 回放置し、室温で 4 ～ 5 分間インキュベートします。
Δ 静かに転倒混和します。ボルテックスによりゲノム DNA の断片化が起こり、抽出されたプラスミドにゲノム DNA 断片が生じます。この時点で、溶液は粘稠で半透明になり、細菌が完全に溶解したことを示します。プラスミドの破壊を避けるため、この時間は 5 分を超えないようにしてください。溶液が透明でない場合は、細菌が多すぎる可能性があります。溶解が不完全であるため、細菌の量を適切に減らす必要があります。
4. ステップ 3 の細菌懸濁液に 7.5 ml の緩衝液 P4 を加え、すぐに 6 ～ 8 回穏やかに転倒混和して、溶液が緩衝液 P2 を完全に中和できるようにします。このとき、白い綿状の沈殿物が現れるはずです。約 11,000 rpm (12,000 × g) 以上で 10 ～ 15 分間遠心分離し、上清を慎重にピペットで新しい 50 ml 丸底遠心管 (自己準備) に移します。浮遊する白い沈殿物を吸引します。
Δ バッファー P4 を加え、すぐに反転してよく混合します。中和に影響を与える可能性のある局所的な沈殿物の生成を防ぐため、白い沈殿物が溶液全体に均一に分散されるまでチューブを放置します。遠心分離前に均一な白い綿状の沈殿物がなく、遠心分離後も上清が透明でない場合は、チューブを使用できません。さらに5分間遠心分離します。
5. 0.1 倍量 (上清量の 10%、約 2.2 ml) のエンドトキシン スカベンジャーをステップ 4 の上清に加え、反転して混合します。溶液を氷浴に入れるか、砕いた氷（または冷蔵庫の冷凍庫）に入れて、溶液が濁った状態から透明な状態（または静止状態）に変化するまで 5 分間放置します。若干濁ります）を時々数回混ぜます。
Δ エンドトキシンスカベンジャーを上清に添加すると、上清は濁りますが、氷浴で冷却した後、上清は透明 (またはわずかに濁る) になるはずです。
6. 上清を室温（>25℃）に 10 ～ 15 分間放置すると、上清が白濁します。その温度は室温まで上昇します。次に、上清を反転して混合する必要があります。
Δ 室温が低い場合、または抽出時間を短縮したい場合は、上清を 37 ～ 42 ℃のウォーターバスで 5 ～ 10 分間インキュベートし、上清を除去した後に次のステップを実行できます。濁る。
7. 上清を室温 (温度は 25℃以上でなければなりません) で約 11,000 rpm (12,000 × g) で 10 分間遠心分離し、相を分離します。上部の水相には DNA が含まれており、下部の青い油相層にはエンドトキシンやその他の不純物が含まれています。転送するDNAを含む水相を新しいチューブに移し、油層を捨てます。
Δ 効果的な相分離が行われないため、遠心分離中の温度は 25℃ 以上でなければなりません。温度が低すぎる場合に発生します。
Δ 相分離が効果的でない場合は、遠心分離温度を 30℃ に調整して、遠心分離時間は 15 分まで延長できます。
Δ 青い油層にはエンドトキシンやその他の不純物が含まれているため、吸引しないでください。
機構
再懸濁 溶解 中和
◇ 7.5mlのバッファーP1を追加
◇ 7.5mlのバッファーP2を追加
◇ 7.5mlのバッファーP4を追加
エンドトキシンの除去
◇エンドトキシンスカベンジャーを上清量の0.1倍添加
結束と洗浄
◇イソプロパノールを0.5倍量加える
◇ Buffer PW 10mlを追加
◇ Buffer PW 10mlを追加
溶出
◇ 1 ～ 2 ml の Buffer TB またはエンドトキシンフリーの ddH2O を追加します。
