mRNA Cap2'-O-メチルトランスフェラーゼ

mRNA Cap 2' -O-メチルトランスフェラーゼは、ワクシニア mRNA Cap 2' -O-メチルトランスフェラーゼの遺伝子を保有する組換え大腸菌株に由来しました。この酵素は、RNA の 5' 末端のキャップ構造に隣接する最初のヌクレオチドの 2'-O 位にメチル基を追加します。この酵素は、S-アデノシルメチオニン (SAM) をメチル供与体として利用して、キャップ付き RNA (キャップ) をメチル化します。 -0) キャップ 1 構造になります。

Cap1 構造は翻訳効率を高め、トランスフェクションやマイクロインジェクション実験における mRNA の発現を改善します。この酵素は基質として m7GpppN キャップを持つ RNA を特に必要とします。5' 末端に pN、ppN、pppN、または GpppN を持つ RNA は利用できません。キャップ付き RNA は、キャップアナログを使用した in vitro 転写によって、またはワクシニア キャッピング酵素を使用した酵素的キャッピングによって調製できます。

コンポーネント

mRNA キャップ 2´-O-メチルトランスフェラーゼ (50U/μL)

10×キャッピング反応バッファー

ストレージ

-25 ～-15℃で保存（凍結融解の繰り返しは避けてください）

ストレージバッファ

20 mM Tris-HCl（pH 8.0、25℃）、100 mM NaCl、1 mM DTT、0.1 mM EDTA、0.1% Triton X-100、50% グリセロール。

単位の定義

1単位は、37℃で1時間以内に10ピコモルの80ntキャップ付きRNA転写産物をメチル化するのに必要な酵素の量として定義されます。

品質管理アッセイ

エキソヌクレアーゼ：50UのmRNA Cap 2 ´ -O-メチルトランスフェラーゼと1μgのλ-Hind III消化DNAを37℃で16時間処理しても、アガロースゲル電気泳動により分解が生じません。

エンドヌクレアーゼ: 50 U の mRNA Cap 2 ´ -O-メチルトランスフェラーゼと 1 μg の λDNA を 37℃ で 16 時間処理しても、アガロースゲル電気泳動により分解が生じません。

ニッケス: 50UのmRNA Cap 2 ´ -O-メチルトランスフェラーゼを1μgのpBR322とともに37℃で16時間処理しても、アガロースゲル電気泳動で測定されたように分解は生じません。

RNase: 50U の mRNA Cap 2 ´ -O-メチルトランスフェラーゼと 1.6μg MS2 RNA を 37℃で 4 時間処理しても、アガロースゲル電気泳動で分解されないことが確認されました。

E. 大腸菌 DNA: 50U の mRNA Cap 2 ´ -O-メチルトランスフェラーゼの存在をスクリーニングします。E. 大腸菌 に特異的なプライマーを使用した TaqMan qPCR を使用したゲノム DNAE. 大腸菌 16S rRNA 遺伝子座。のE. 大腸菌 ゲノム DNA 汚染 =1E. 大腸菌 ゲノム。

細菌性 エンドトキシン: LAL 試験、中国薬局方 IV 2020 版、ゲル限界試験方法、一般規則 (1143) に準拠。細菌のエンドトキシン含有量は =10 EU/mg である必要があります。

反応系と反応条件

1. 適切な量の Capped RNA と RNase-free H2O を 1.5 mL 微量遠心分離チューブ中で最終容量 16.0 µL になるまで混ぜ合わせます。

2. 65℃で5分間加熱し、その後氷浴で5分間加熱します。

3. 以下のコンポーネントを指定された順序で追加します (Capped RNA のメチル化の場合)

10未満

*10× キャッピング反応バッファー: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0、25℃)、50 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM DTT。

4. 37℃で 1 時間インキュベートします (200 nt 未満のターゲットフラグメントの場合は 2 時間のインキュベーションを推奨します)。

アプリケーション

マイクロインジェクションおよびトランスフェクション実験中の mRNA 発現を改善します。

使用上の注意

1. 反応前に RNA を精製し、ヌクレアーゼフリーの水に溶解する必要があります。すべての溶液には EDTA やイオンが含まれていてはなりません。

2. 転写産物の 5' 末端の二次構造を除去するために、反応前にサンプル RNA を 65℃ で 5 分間加熱することをお勧めします。複雑な 5 ' 末端構造の場合は 10 分まで延長できます。