PNGase F
ペプチド-N-グリコシダーゼ F(PNGase F) は、糖タンパク質からほぼすべての N 結合型オリゴ糖を除去するための最も効果的な酵素法です。PNGase F はアミダーゼで、N 結合型糖タンパク質の高マンノース、ハイブリッド、複合オリゴ糖の最も内側の GlcNAc 残基とアスパラギン残基の間を切断します。
応用
この酵素は、タンパク質から炭水化物残基を除去するのに役立ちます。
準備と仕様
| 外観 | 無色の液体 |
| タンパク質の純度 | ≥95% (SDS-PAGE より) |
| 活動 | ≧500,000 U/mL |
| エキソグリコシダーゼ | アクティビティは検出されませんでした (ND) |
| エンドグリコシダーゼ F1 | ND |
| エンドグリコシダーゼ F2 | ND |
| エンドグリコシダーゼ F3 | ND |
| エンドグリコシダーゼH | ND |
| プロテアーゼ | ND |
プロパティ
| EC番号 | 3.5.1.52（微生物由来の組換え体） |
| 分子量 | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| 等電点 | 8.14 |
| 最適なpH | 7.0～8.0 |
| 最適な温度 | 65℃ |
| 基質特異性 | GlcNAc とアスパラギン残基間のグリコシド結合の切断 図 1 |
| 認識部位 | α1-3 フコースを含まない N 結合型糖鎖 図 2 |
| 活性剤 | DTT |
| 阻害剤 | SDS |
| 保管温度 | -25～-15℃ |
| 熱不活化 | 1μL の PNGase F を含む 20μL の反応混合物を、75 °C で 10 分間インキュベートすることにより不活化します。 |
図1 PNGase Fの基質特異性
図2 PNGase Fの認識位置
内部 GlcNAc 残基が α1-3 フコースに結合している場合、PNGase F は糖タンパク質から N 結合型オリゴ糖を切断できません。この修飾は植物や一部の昆虫の糖タンパク質によく見られます。
Cコンポーネント
|
| コンポーネント | 集中 |
| 1 | PNGase F | 50μl |
| 2 | 10×糖タンパク質変性バッファー | 1000μl |
| 3 | 10×グリコバッファー2 | 1000μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000μl |
単位の定義
1 ユニット (U) は、総反応量 10 µL、37℃、1 時間で 10 µg の変性 RNase B から 95% を超える炭水化物を除去するのに必要な酵素の量として定義されます。
反応条件
1. 1 ～ 20 µg の糖タンパク質を脱イオン水で溶解し、1 µl の 10×糖タンパク質変性バッファーと H2O (必要な場合) を加えて総反応量を 10 µl にします。
2.100℃で10分間インキュベートし、氷上で冷却します。
3.2 μl 10×GlycoBuffer 2、2 μl 10% NP-40 を加えて混合します。
4.1 ～ 2 µl の PNGase F および H を追加します2O (必要な場合) を加えて総反応量を 20 μl にし、混合します。
5.反応を37℃で60分間インキュベートします。
6.SDS-PAGE分析またはHPLC分析用。
