ワクシニアウイルスキャッピング酵素
ワクシニアウイルスキャッピング酵素は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素の遺伝子を保有する組換え大腸菌株に由来します。この単一の酵素は 2 つのサブユニット (D1 および D12) で構成され、3 つの酵素活性 (D1 サブユニットによる RNA トリホスファターゼとグアニリルトランスフェラーゼ、および D12 サブユニットによるグアニンメチルトランスフェラーゼ) を持ちます。ワクシニアウイルスキャッピング酵素は、7-メチルグアニル酸キャップ構造 (m7Gppp、Cap 0) を RNA の 5' 末端に特異的に結合できるキャップ構造の形成を触媒するのに効果的です。キャップ構造 (Cap 0) は、真核生物における mRNA の安定化、輸送、翻訳において重要な役割を果たしています。酵素反応による RNA のキャッピングは、in vitro 転写、トランスフェクション、およびマイクロインジェクションにおける RNA の安定性と翻訳を大幅に改善できる効果的かつ簡単な方法です。
コンポーネント
ワクシニアウイルスキャッピング酵素 (10 U/μL)
10×キャッピングバッファ
保管条件
-25～-15℃で保存（凍結融解の繰り返しは避けてください）
ストレージバッファ
20 mM トリス-HCl (pH 8.0)、100 mM NaCl、
1mM DTT、0.1mM EDTA、0.1% Triton X-100、50% グリセロール。
単位の定義
ワクシニアウイルスキャッピング酵素の1単位は、37℃で1時間以内に10pmolのGTPを80ntの転写物に組み込むのに必要な酵素の量として定義されます。
品質管理
エキソヌクレアーゼ:10Uのワクシニアウイルスキャッピング酵素と1μgのλ-Hind III消化DNAを37℃で16時間処理しても、アガロースゲル電気泳動により分解されないことが確認されました。
エンドヌクレアーゼ:アガロースゲル電気泳動により、10Uのワクシニアウイルスキャッピング酵素と1μgのλDNAを37℃で16時間反応させても分解は生じません。
ニッケス:10Uのワクシニアウイルスキャッピング酵素を1μgのpBR322とともに37℃で16時間処理しても、アガロースゲル電気泳動で測定されたように、分解は生じません。
RNase:10Uのワクシニアウイルスキャッピング酵素を1.6μgのMS2 RNAとともに37℃で4時間処理しても、アガロースゲル電気泳動で測定されたように分解は生じません。
1.大腸菌DNA:10U のワクシニア ウイルス キャッピング酵素を、大腸菌 16S rRNA 遺伝子座に特異的なプライマーを使用した TaqMan qPCR を使用して大腸菌ゲノム DNA の存在についてスクリーニングします。大腸菌ゲノム DNA の混入は 1 大腸菌ゲノム以下です。
2.細菌性 エンドトキシン: 中国薬局方 IV 2020 版、ゲル限界試験方法、一般規則 (1143) による LAL テスト。細菌のエンドトキシン含有量は 10 EU/mg 以下である必要があります。
反応系と反応条件
1. キャッピングプロトコル (反応量: 20 μL)
この手順は 10μg RNA (≥100 nt) のキャッピング反応に適用でき、実験の要求に応じてスケールアップできます。
I) 10μg RNA とヌクレアーゼフリー H2O を 1.5 ml 微量遠心分離チューブ中で最終容量 15.0 μL まで混合します。*10×キャッピングバッファー: 0.5M Tris-HCl、50 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM DTT、(25℃、pH 8.0)
2) 65℃で5分間加熱し、その後氷浴で5分間加熱します。
3) 以下のコンポーネントを指定された順序で追加します。
| Cコンポーネント | Vオルメ |
| 変性 RNA (≤10μg、長さ ≥100 nt) | 15μL |
| 10×キャッピングバッファ* | 2μL |
| GTP(10mM) | 1μL |
| SAM(2mM) | 1μL |
| ワクシニアウイルスキャッピング酵素（10U/μL） | 1μL |
*10×キャッピングバッファー：0.5 M Tris-HCl、50 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM DTT、(25℃、pH8.0)
4) 37℃で 30 分間インキュベートすると、RNA がキャップされ、下流のアプリケーションに使用できるようになります。
2. 5'端子 標識反応 (反応量: 20 μL)
このプロトコルは、5' 三リン酸を含む RNA を標識するように設計されており、要求に応じてスケールアップできます。ラベルの取り込み効率は、RNA:GTP のモル比、および RNA サンプル中の GTP 含有量によって影響されます。
1) 適切な量の RNA とヌクレアーゼフリーの H2O を 1.5 ml 微量遠心分離チューブ中で最終容量 14.0 μL まで混ぜ合わせます。
2) 65℃で5分間加熱し、その後氷浴で5分間加熱します。
3)以下のコンポーネントを指定された順序で追加します。
| Cコンポーネント | Vオルメ |
| 変性RNA | 14μL |
| 10×キャッピングバッファ | 2μL |
| GTP ミックス** | 2μL |
| SAM(2mM) | 1μL |
| ワクシニアウイルスキャッピング酵素（10U/μL） | 1μL |
** GTP MIX は、GTP と少数のマーカーを指します。GTP濃度についてはこちらをご覧ください。注3へ。
4) 37°C で 30 分間インキュベートします。RNA 5' 末端が標識され、下流の準備が整います。
アプリケーション
1. 翻訳アッセイ/in vitro 翻訳前の mRNA のキャッピング
2. mRNA の 5' 末端の標識
使用上の注意
1.ワクシニアキャッピング酵素とインキュベートする前に RNA 溶液を加熱すると、転写産物の 5' 末端の二次構造が除去されます。既知の高度に構造化された 5 末端を持つ転写産物の場合は、時間を 60 分に延長します。
2. キャッピング反応に使用する RNA は使用前に精製し、ヌクレアーゼフリーの水に懸濁する必要があります。EDTA は存在してはならず、溶液には塩が含まれていない必要があります。
3. 5' 末端を標識するには、総 GTP 濃度が反応中の mRNA のモル濃度の約 1 ～ 3 倍である必要があります。
4. 反応系の容積は実際に応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。
