DNA抽出ミニキット
このキットは、最適化されたバッファーシステムとシリカゲルカラム精製技術を採用しており、さまざまな濃度の TAE または TBE アガロースゲルから 70 bp ～ 20 kb の DNA 断片を回収できます。DNA吸着カラムは高塩条件下でのDNAの吸着に特化しています。さらに、このキットは、PCR産物、酵素反応系、または他の方法で得られた粗DNA産物からDNA断片を直接精製し、タンパク質、その他の有機化合物、無機塩イオン、オリゴヌクレオチドプライマーなどの不純物を除去することができます。精製は 10 ～ 15 分以内に完了することが保証されます。精製された DNA は、ライゲーション、形質転換、酵素消化、インビトロ転写、PCR、配列決定、マイクロインジェクションなどに直接使用できます。
保管条件
-15 ～ -25℃で保管し、室温で輸送してください。
コンポーネント
| コンポーネント | (100受信数) |
| GDPを緩衝する | 80ml |
| バッファGW | 20ml×2本 |
| 溶出バッファー | 20ml |
| FastPure DNA ミニカラム-G | 100 |
バッファーGDP:DNA結合バッファー。
バッファGW:洗浄緩衝液；使用前にボトルに表示された量の無水エタノールを加えてください。
溶出バッファー:溶出。
FastPure DNA ミニカラム-G:DNA吸着カラム。
コレクションチューブ 2ml:濾液用の回収チューブ。
準備した材料
1.5 ml 滅菌チューブ、無水エタノール、イソプロパノール（DNA 断片が 100 bp 以下の場合は 1 倍量を追加）
イソプロパノールを 1 容量のゲルに加えて)、水浴。
実験プロセス
使用前に、タグの指示に従って 80 ml のエタノールを加えて Buffer GW を希釈し、室温で保管します。
機構
1. PCR反応液
ゲル抽出スキーム: 等量のバッファーを追加 GDP PCR 反応液回収スキーム:5倍の量のバッファを追加
2. GDP ゲルの体積を計算します(100 μl は 100 mg に相当します）
ジェルを溶かす
3. 50〜55で予熱します℃
4. バインドウォッシュ
300 μL のバッファー GDP* を追加
700μLのBuffer GWを加える
700μLのBuffer GWを加える
5. 溶出
20 ～ 30μL の溶出バッファーまたは脱イオン水を追加します。
注意事項* この工程を行わずにPCR反応液を回収する場合
ゲル抽出プログラム
1. DNA 断片を分画するための DNA 電気泳動後、UV 光下でアガロースゲルから DNA 断片の単一ストライプを切り出します。吸収紙を使用してゲルの見かけの水分を吸収し、余分なアガロースをできるだけ除去してゲルスライスのサイズを最小限に抑えることをお勧めします。ゲルスライス (微量遠心管なし) の重量を量って、その体積を計算します。密度を 1 g/ml と仮定すると、100 mg のゲルスライスの体積は約 100 μL です。
2. 等量の Buffer GDP を加え、50 ～ 55℃で 7 ～ 10 分間インキュベートします (ゲルのサイズに応じて、ゲルが完全に溶解するまでインキュベーション時間を調整します)。インキュベーション中にチューブを 2 回反転させます。
Δ 1 ～ 3 倍量のバッファー GDP を追加しても、DNA 回収効率には影響しません。回収する DNA フラグメントが 100 bp 未満の場合は、3 倍量の Buffer GDP を追加する必要があります。ゲルスライスが完全に溶解したら、1 倍量のイソプロパノールを加えて完全に混合し、次のステップに進みます。
3. 軽く遠心分離してサンプルをチューブの底に集め、FastPure DNA Mini Columns-G を Collection Tubes 2 ml に挿入し、最大 700 μL の溶液を 1 回につき注意深く移します。
ろ過カラムに入れるまでの時間、12,000 rpm (13,800 X g) で 30 ～ 60 秒間遠心分離します。
4. 濾液を捨て、300 μL の Buffer GDP をカラムに加え、室温で 1 分間インキュベートし、12,000 rpm (13,800 X g) で 30 ～ 60 秒間遠心分離します。
5. 濾液を捨て、700 μL の Buffer GW (無水エタノールが事前に添加されているか確認してください) をカラムに加え、12,000 rpm (13,800 X g) で 30 ～ 60 秒間遠心分離します。
Δ Buffer GW を吸着カラム壁の周囲に追加するか、Buffer GW の裏蓋を追加して 2 ～ 3 回上下逆に混ぜて、管壁に付着した塩を完全に洗い流してください。
6. ステップ 5 を繰り返します。
Δ Buffer GW で 2 回フラッシングすることで、塩を完全に除去し、その後の実験への影響を排除できます。
7. 濾液を捨て、空のカラムを 12,000 rpm (13,800 X g) で 2 分間遠心分離します。
8. カラムを清潔な 1.5 ml 微量遠心管に挿入し、20 ～ 30 μL の溶出バッファーをカラム膜の中心に加え、2 分間インキュベートし、その後 12,000 rpm (13,800 X g) で 1 分間遠心分離します。カラムを捨て、得られた DNA を -20 ℃で保存します。
Δ ステップ 8 の上清をカラムに移して再度溶出し、溶出バッファーを 55 ℃に予熱すると (DNA フラグメント > 3 kb の場合)、回収効率を高めるのに役立つ場合があります。
PCR産物回収プログラム
このプロトコルは、PCR 産物、酵素反応系、およびその他の DNA 粗産物 (遺伝子 DNA を含む) からの DNA 断片の精製に適用できます。この溶液は、さまざまなヌクレオチド、プライマー、プライマーダイマー、塩分子、酵素、その他の不純物を効率的に除去できます。
1. PCR産物、酵素反応液、その他のDNA粗生成物を簡単に遠心分離します。ピペットでその体積を見積もり、滅菌した 1.5 ml または 2 ml チューブに移します。容量が 100 μL になるまで ddH2O を加えます。一方、高濃度のゲノム DNA の場合は、ddH2O で 300 μL に希釈すると回収効率が向上します。
2. 5 倍量の Buffer GDP を加え、転倒またはボルテックスして完全に混合します。目的の DNA フラグメントが 100 bp を超える場合は、さらに 1.5 容量 (サンプル + バッファー GDP) のエタノールを添加する必要があります。
3. カラムをコレクションチューブに戻し、混合物をカラムに移し、12,000 rpm (13,800 ×g) で 30 ～ 60 秒間遠心分離します。混合溶液の量が 700 µL 以上の場合は、吸着カラムをコレクションチューブに戻し、残りの溶液を吸着カラムに移し、12,000 rpm (13,800 × g) で 30 ～ 60 秒間遠心分離します。
4. 次のパフォーマンスは、08-1/ゲル抽出プログラムのステップ 5 ～ 8 を指します。
アプリケーション
さまざまな濃度の TAE または TBE アガロースゲル。PCR産物、酵素反応系、またはさまざまな方法で得られるその他の粗DNA産物。回収された断片の範囲は次のとおりです。70 bp -20 kb。
ノート
研究用途のみ。診断手順には使用できません。
1. 使用前にタグに示されているように、80 ml のエタノールを緩衝液 GW に加えて希釈し、室温で保管します。
2. 低温保管中に緩衝液 GDP が沈殿しやすい場合は、使用前に一定期間室温に置いても構いません。必要に応じて、沈殿物が完全に溶解するまで37℃のウォーターバスで予熱し、混合してから使用できます。
3. あらかじめ水槽温度を50～55℃に設定してください。
4. 08-1/ゲル抽出プログラムのステップ 1 では、ゲルスライスのサイズを最小限に抑えると、溶解時間が大幅に短縮され、回収効率が向上します (直鎖状 DNA は高温にさらされ続けると容易に加水分解します)。紫外線は DNA 損傷を引き起こす可能性があるため、DNA ゲルを長時間 UV にさらさないでください。
5. 08-1/ゲル抽出プログラムステップ 2 でゲルを完全に溶解します。そうしないと、DNA 回収効率が重大な影響を受けます。
6. 溶出バッファーまたは ddH2O を 55℃ に予熱します。これは DNA 溶出効率を向上させるのに役立ちます。DNA は 2.5 mM Tris-HCl、pH 7.0 ～ 8.5 の溶離液で保存することをお勧めします。
