植物ダイレクト PCR キット

カタログ番号: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit は、植物の葉や種子などの直接増幅に適しており、多糖類やポリフェノールを含まない植物サンプルのハイスループットスクリーニングに使用できます。定向進化に基づく直接増幅 DNA ポリメラーゼは、植物の PCR 阻害剤に対して優れた耐性を持っています。一方で、5kb以内のDNA断片の増幅に適した高い増幅性能を維持しています。キットに含まれる独自の溶解バッファー A を使用して、新鮮または凍結した植物組織を溶解できます。操作が簡単で、ライセートを精製せずに増幅のテンプレートとして使用できます。このシステムには、凍結と解凍を繰り返した後に粗サンプルを効果的に増幅できるようにする保護剤が含まれています。2 × Plant Direct Master Mix は、プライマーとテンプレートを追加するだけで増幅反応を実行できるため、ピペッティング操作が軽減され、検出スループットと結果の再現性が向上します。

コンポーネント

*Plant Direct Lysis Buffer B はオプションの試薬で、サンプルの保存時間を延長するために Plant Direct Lysis Buffer A を中和するために使用されます。実際の状況に応じて使用できます。

保管条件

2 × プラント ダイレクト マスター ミックス、-30 ～ -15℃で保存し、繰り返しの凍結と解凍を避けてください。Plant Direct Lysis Buffer は、-30 ～ -15℃ または 2 ～ 8℃ で保存してください。

実験プロセス

サンプル処理–植物の葉

直接法:若い葉を使うのがおすすめです。直径 0.5 ～ 3 mm の固定穴パンチを使用して小さく均一なサンプルを採取し、そのサンプルを PCR システムに直接追加します (50 μl システムを推奨)。サンプルが PCR 溶液中にあり、チューブの壁に当たっていないことを確認してください。ダイレクト PCR を使用して長いフラグメントや複雑なサンプルを増幅する場合、より小さな直径 (0.5 ～ 1 mm) のサンプルをテンプレートとして使用すると、より良い結果が得られます。

粉砕溶解法：若葉を使うのがおすすめです。葉の小片 (直径約 1 ～ 3 mm) を取り、20 μl の Plant Direct Lysis Buffer Ab に入れ、可能な限り粉砕します (このステップは、100 μl ピペット チップで葉を絞ることによって行うことができます)サンプルをマッシュするため）。より大量の葉組織を使用する場合 (7 mm を超えない)、希釈バッファーの量を 50 μl に増やします。葉を粉砕すると、溶液は緑色に見えるはずです。簡単な遠心分離の後、1 μl の上清を反応テンプレートとして PCR システムに加えます c 。

熱溶解法:若葉を使うのがおすすめです。葉の小片（直径約 1 ～ 3 mm）を取り、20 μl の Plant Direct Lysis Buffer A に入れ、95°C で 5 ～ 10 分間加熱します。溶解が難しい葉の場合は、溶解時間を適切に延長することができます (20 分以内)。より大量の葉組織を使用する場合 (7 mm を超えない)、希釈バッファーの量を 50 μl に増やします。加熱後、軽く遠心分離し、上清 1 μl を反応鋳型として PCR システムに加えます。

サンプル処理–植物の種

粉砕溶解法：メスを使用して直径 5 mm の種子を切断し、100 μl の Plant Direct Lysis Buffer A に加え、ピペットチップまたはその他のツールでサンプルを粉砕します。軽くボルテックスし、室温で 3 ～ 5 分間放置します。種子サンプルが希釈バッファーに浸されていることを確認してください。簡単な遠心分離後、上清 1 μl を反応テンプレートとして PCR システムに加えます。

熱溶解法:種子をメスで直径 5 mm に切り、100 μl の Plant Direct Lysis Buffer A に加え、95℃で 5 ～ 10 分間加熱します。溶解が難しい葉の場合は、溶解時間を適切に延長することができます (30 分以内)。加熱後、軽く遠心分離し、上清 1 μl を反応鋳型として PCR システムに加えます。

ａ．はさみやその他のツールを使用して、サンプルを適切なサイズに切断することもできます。パンチまたはハサミを再利用する場合は、サンプル間の相互汚染を防ぐために、毎回使用する前に 2% 次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄する必要があります。

b.使用前に Plant Direct Lysis Buffer が完全に溶けていることを確認してください。緩衝液が粘稠な場合や沈殿がある場合は、37℃に加熱して完全に溶かしてから使用してください。

c.反応系中の鋳型の量は、添加する植物材料や希釈剤の量の違いに応じて適宜調整することができる。

植物直接溶解バッファー

この製品に含まれる Plant Direct Lysis Buffer A は、ほとんどの植物組織のゲノムを放出できるように厳密に最適化されており、4℃での未加工植物の短期保存に適しています。サンプルを長期間（1 ～ 2 か月など）保存する必要がある場合は、上清を新しい EP チューブに移し、-20℃で保存することをお勧めします。サンプルをより安定に保存するには、移した上清に等量の Plant Direct Lysis Buffer B を加え、よく混合し、-20℃で保存します。安定した保存期間は植物のサンプルや状態によって異なります。

反応システム

ａ．マグネシウムが含まれています²⁺最終濃度は 2 mM です。

b.各プライマーの最終濃度は 0.4μM を使用することをお勧めします。プライマーを過剰に使用すると、非特異的増幅が増加します。

c.使用するサンプルの量は実際の状況に応じて調整できます。1 回の反応で使用される粗溶解サンプルの量は、反応総量の 2% ～ 20% の間で調整できます。サンプルを多量に使用すると、増幅が失敗する可能性があります。

リアクションプログラム

ａ．初期変性 (98℃、5 分) により植物組織の溶解が促進され、PCR 増幅に使用できるゲノム DNA が放出されます。時間を短くしたり、温度を下げたりしないでください。

b.プライマーのTm値と同じか、Tm値より2～4℃高い温度に設定することを推奨します。この製品で使用されている直接増幅 DNA ポリメラーゼは、従来の Taq DNA ポリメラーゼとは異なり、反応アニーリング温度に特別な要件があります。高いアニーリング温度を使用することで、非特異的増幅を効果的に低減し、増幅効率を向上させることができます。複雑なテンプレートの場合、アニーリング温度を調整し、伸長時間を延長することで効率的な増幅を実現できます。

c.増幅産物の長さが 1 kb 以下の場合、伸長時間は 30 秒/kb に設定されます。増幅産物の長さが >1 kb の場合、伸長時間は 60 秒/kb に設定されます。

d.複雑なサンプルまたは増幅収率が低いサンプルの場合、サイクル数を 40 ～ 50 サイクルに適切に増やすことができます。

アプリケーション

植物組織の直接増幅や、多糖類やポリフェノールを含まない植物サンプルのハイスループットスクリーニングに適用できます。

ノート

研究用途のみ。診断手順には使用できません。

1. 粗植物増幅または直接増幅の場合、システム、プライマー、および操作が正しいことを確認するために、実験を開始する前に精製ゲノム DNA をポジティブコントロールとして使用することをお勧めします。

2. このキットで使用されている直接増幅 DNA ポリメラーゼは、強力な校正活性を持っています。TA クローニングを実行する必要がある場合は、アデニンを追加する前に DNA を精製することをお勧めします。

3. プライマー設計のガイダンス：

ａ．プライマーの 3' 末端の最後の塩基は G または C にすることをお勧めします。

b.プライマーの 3' 末端の最後の 8 塩基で連続するミスマッチを避ける必要があります。c.プライマーの 3' 末端のヘアピン構造を避けてください。

d.フォワードプライマーとリバースプライマーのTm値の差は1℃以内とし、Tm値は60～72℃に調整してください（Tm値の計算にはプライマープレミア5を推奨します）。

e.テンプレートと一致しない追加のプライマー配列は、プライマー Tm 値を計算するときに含めるべきではありません。

f.プライマーの GC 含有量は 40% ～ 60% であることが推奨されます。

g.プライマー中の A、G、C、および T の全体的な分布は、可能な限り均一である必要があります。GC または AT の含有量が多い領域の使用は避けてください。

h.プライマー内または 2 つのプライマー間に 5 塩基以上の相補配列が存在することを避け、2 つのプライマーの 3' 末端に 3 塩基以上の相補配列が存在することを避けてください。

私。NCBI BLAST 機能を使用してプライマーの特異性をチェックし、非特異的増幅を防ぎます。