プロテイナーゼK NGS（粉末）
カタログ番号: HC4507A
NGS プロテアーゼ K は、高い酵素活性と幅広い基質特異性を備えた安定なセリンプロテアーゼです。この酵素は、疎水性アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸の C 末端に隣接するエステル結合およびペプチド結合を優先的に分解します。そのため、タンパク質を短いペプチドに分解するためによく使用されます。NGS プロテアーゼ K は、Asp を持つ典型的なセリン プロテアーゼです。39-彼の69-サー224セリンプロテアーゼに特有の触媒三本柱であり、触媒中心は2本のCaで囲まれています。2+結合部位を安定化させ、幅広い条件下で高い酵素活性を維持します。
仕様
| 外観 | 白からオフホワイトの非晶質粉末、凍結乾燥 |
| 特定の活動 | ≧40U/mg固形物 |
| DNase | 何も検出されませんでした |
| RNase | 何も検出されませんでした |
| バイオバーデン | ≤50CFU/g固体 |
| 核酸残基 | <5pg/mg固体 |
プロパティ
| ソース | トリチラキウムのアルバム |
| EC番号 | 3.4.21.64(トリチラキウムアルバムからの組換え) |
| 分子量 | 29kDa (SDS-PAGE) |
| 等電点 | 7.81 図1 |
| 最適なpH | 7.0 ～ 12.0 (すべて高活性を実行) 図 2 |
| 最適な温度 | 65℃ 図3 |
| pH安定性 | pH 4.5～12.5 (25℃、16h) 図4 |
| 熱安定性 | 50℃以下（pH8.0、30分） 図5 |
| 保存安定性 | 25℃で12ヶ月保存 図6 |
| 活性剤 | SDS、尿素 |
| 阻害剤 | フルオロリン酸ジイソプロピル;ベンジルスルホニルフルオリド |
保管条件
凍結乾燥粉末は-25~-15℃で光を避けて長期保存してください。溶解後、短期保存の場合は2～8℃、遮光、長期保存の場合は-25～-15℃で適量に分注してください。
予防
使用時や計量時は保護手袋や保護メガネを着用し、使用後は換気をよくしてください。この製品は、皮膚アレルギー反応や重篤な眼刺激を引き起こす可能性があります。吸入すると、アレルギーや喘息の症状、呼吸困難を引き起こす可能性があります。呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。
単位の定義
NGS プロテアーゼ K の 1 単位は、標準的な測定条件下でカゼインを 1 μmol の L-チロシンに加水分解するのに必要な酵素の量として定義されます。
試薬の準備
| 試薬 | メーカー | カタログ |
| カゼインテクニカル牛乳から | シグマ アルドリッチ | C7078 |
| NaOH | シノファームケミカル株式会社リージェント | 10019762 |
| いや2PO4・2H2O | シノファームケミカル株式会社リージェント | 20040718 |
| Na2HPO4 | シノファームケミカル株式会社リージェント | 20040618 |
| トリクロロ酢酸 | シノファームケミカル株式会社リージェント | 80132618 |
| 酢酸ナトリウム | シノファームケミカル株式会社リージェント | 10018818 |
| 酢酸 | シノファームケミカル株式会社リージェント | 10000218 |
| 塩酸 | シノファームケミカル株式会社リージェント | 10011018 |
| 炭酸ナトリウム | シノファームケミカル株式会社リージェント | 10019260 |
| フォリンフェノール | サンゴンバイオテック（上海）株式会社。 | A500467-0100 |
| L-チロシン | シグマ | 93829 |
試薬I:
基質: 牛乳由来の 1% カゼイン溶液: 1 g の牛乳カゼインを 50 ml の 0.1M リン酸ナトリウム溶液、pH 8.0 に溶解し、水浴中で 65 ～ 70 °C で 15 分間加熱し、撹拌して溶解し、水で冷却し、次のように調整します。水酸化ナトリウムをpH 8.0に調整し、100mlに希釈します。
試薬 II:
TCA 溶液: 0.1M トリクロロ酢酸、0.2M 酢酸ナトリウムおよび 0.3M 酢酸 (トリクロロ酢酸 1.64g + 酢酸ナトリウム 1.64g + 酢酸 1.724mL を順次秤量し、脱イオン水 50mL を加え、HCl で pH 4.03 に調整し、 100ml）。
試薬III:
0.4m炭酸ナトリウム溶液（無水炭酸ナトリウム4.24gを量り、100mLの水に溶かす）
試薬 IV:
フォーリンフェノール試薬: 脱イオン水で 5 倍に希釈します。
試薬 V:
酵素希釈剤: 0.1 M リン酸ナトリウム溶液、pH 8.0。
試薬 VI:
L-チロシン標準溶液：0、0.005、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25μmol/mlのL-チロシンを0.2M HClに溶解したもの。
手順
1. UV-Vis 分光光度計をオンにし、測光を選択します。
2. 波長を 660nm に設定します。
3. ウォーターバスのスイッチを入れ、温度を 37℃ に設定し、温度が変わらないことを 3 ～ 5 分間確認します。
4. 2 mL 遠沈管に 0.5 mL の基質を入れ、37℃ ウォーターバスで 10 分間予熱します。
5. 0.5mL の希釈酵素溶液を予熱した遠沈管に 10 分間抽出します。酵素希釈液をブランクグループとして設定します。
6. 反応直後に 1.0 mL TCA 試薬を加えます。よく混合し、ウォーターバスで 30 分間インキュベートします。
7. 反応溶液を遠心分離します。
8. 次のコンポーネントを指定された順序で追加します。
| 試薬 | 音量 |
| 上清 | 0.5mL |
| 0.4M 炭酸ナトリウム | 2.5mL |
| フォリンフェノール試薬 | 0.5mL |
9. よく混合してから、37℃のウォーターバスで 30 分間インキュベートします。
10.外径660ODと判定されました1;ブランク対照グループ: OD を決定するために酵素溶液の代わりに酵素希釈液を使用します。660ODとして2、ΔOD=OD1-OD2.
11. L-チロシン標準曲線：異なる濃度の L-チロシン溶液 0.5mL、0.4M 炭酸ナトリウム 2.5mL、フォリンフェノール試薬 0.5mL を 5mL 遠心管に入れ、37℃で 30 分間インキュベートし、OD を検出します。660異なる濃度の L-チロシンについて、標準曲線 Y=kX+b が得られます。ここで、Y は L-チロシン濃度、X は OD です。600.
計算
2: 反応液の総量(mL)
0.5：酵素液の体積（mL）
0.5：発色測定に使用した反応液量（mL）
10: 反応時間(分)
Df: 希釈倍数
C：酵素濃度（mg/mL）
数字
図1 DNA残基
| サンプル | アベニュー C4 | 核酸 回収率(pg/mg) | 回復（％） | 総核酸 酸（ pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNAフリーH2O | 未定 | — | — | — |
図2 至適pH
図3 最適温度
図4 pH安定性
図5 熱安定性
図6 25℃における保存安定性
