M-MLV 逆転写酵素
RevScript 逆転写酵素は遺伝子工学技術によって得られます。より高いcDNA合成能力、熱安定性、反応温度限界(60℃まで)を備えています。合成された cDNA 産物は最大 10 kb です。テンプレートの親和性が向上し、複雑な二次構造または低コピー遺伝子を持つ RNA テンプレートの逆転写に適しています。
コンポーネント
| 成分 | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript 逆転写酵素 (200U/μL) | 50μL | 5×50μL | 1mL |
| 5 × RevScript バッファ | 250μL | 1.25mL | 5mL |
保存条件
本製品は-25℃～-15℃で2年間保存してください。
単位の定義
1 ユニットは、Oligo(dT) をプライマーとして使用し、37℃で 10 分間で 1 nmol の dTTP を酸不溶性物質に組み込みます。
反応のセットアップ
1.RNA テンプレートの変性 (このステップはオプションです。RNA テンプレートの変性は二次構造を開くのに役立ち、第一鎖 cDNA の収量が向上します。)
| コンポーネント | 音量 （μL) |
| RNase フリー ddH2O | 13まで |
| オリゴ(dT)18 (50μmol/L) またはランダムプライマー(50μmol/L) または遺伝子特異的プライマー (2 μmol/L) | 1 |
| または1 | |
| または1 | |
| RNAテンプレート | X a |
ノート：
1) a: トータル RNA: 1 ～ 5 ug または mRNA: 1 ～ 500 ng
２）６５℃で５分間インキュベートし、その後すぐに氷上に移して２分間冷却する。軽く遠心分離して反応液を回収し、下表に示すように逆転写反応液を加えます。静かにピペッティングして混合します。
1.反応混合物の調製 (20 μL 容量)
| コンポーネント | 音量 （μL) |
| 前のステップの混合物 | 13 |
| 5×バッファ | 4 |
| dNTP ミックス (10nmol/L) | 1 |
| 逆転写酵素 (200 U/μL) | 1 |
| RNase阻害剤（40U/μL） | 1 |
1.以下の条件で反応を行ってください。
| 温度(℃) | 時間 |
| 25℃a | 5分 |
| 42℃b | 15～30分 |
| 85℃c | 5分 |
ノート：
1) a.25°C で 5 分間のインキュベーションは、ランダム六量体を使用する場合にのみ必要です。Oligo (dT) を使用する場合は、この手順をスキップしてください。18または遺伝子特異的プライマー。
2) b.推奨される逆転写温度は 42°C です。複雑な二次構造または高い GC 含有量を持つテンプレートの場合は、反応温度を 50 ～ 55°C に上げることをお勧めします。
3) c.85℃で5分間加熱して逆転写酵素を不活性化します。
4) 製品は PCR または qPCR 反応に直接使用することも、短期保存の場合は -20°C で保存することもできます。長期保存の場合は小分けして-80℃で保存することをお勧めします。頻繁な凍結融解は避けてください。
5) この製品はワンステップ RT-qPCR に適しています。25 μL 反応系ごとに 10 ～ 20 U 逆転写酵素を追加するか、実際の状況に応じて逆転写酵素の量を徐々に増やすことをお勧めします。
ノート
1.実験エリアは清潔に保ってください。操作中は清潔な手袋とマスクを着用してください。RNase 汚染を防ぐために、実験で使用するすべての消耗品は RNase フリーである必要があります。
2.RNA の分解を防ぐために、すべての手順は氷上で行う必要があります。
3.逆転写の高効率を確保するには、高品質の RNA サンプルを推奨します。
4.この製品は研究専用です。
5.安全のため、白衣と使い捨て手袋を着用して作業してください。
